Monoclonal antibodies against an outer membrane protein from pathogenic Leptospira

Two hybridomas secreting monoclonal antibodies (MAbs) that react with a lipoprotein (LipL32) of the outer membrane of pathogenic Leptospira were obtained. For hybridoma production, spleen cells from BALB/c mice imunized with recombinant LipL32 (rLipL32) were fused to SP2/O-Ag14 cells, selected in HAT medium and screened in an indirect ELISA. One MAb produced was of the IgG2b isotype and the other was an IgM. MAbs specificity was confirmed by indirect ELISA and immunoblotting using purified rLipL32 and whole-cell antigen preparations from Escherichia coli (E. coli) expressing LipL32 and from pathogenic and non-pathogenic serovars. Both Mabs reacted with most of the pathogenic serovars tested and none reacted with non-pathogenic Leptospira. The MAbs described have potential for use in diagnostic tests for leptospirosis.

Foram obtidos dois hibridomas secretores de anticorpos monoclonais (MAbs) que reagem com uma lipoproteína (LipL32) da membrana externa de leptospiras patogênicas. Para a produção dos hibridomas, células do baço de camundongos BALB/c, imunizados com LipL32 recombinante (rLipL32), foram fusionadas com células SP2/O-Ag14, selecionadas em meio HAT e testadas em ELISA indireto. Um dos MAbs secretados pelos hibridomas é do isotipo IgG2b e o outro do isotipo IgM. A especificidade dos MAbs foi confirmada em ELISA indireto e immunoblotting usando rLipL32 purificada, Escherichia coli (E. coli) expressando LipL32 e sorovares patogênicos e saprófitas. Os dois MAbs reagiram com a maioria dos sorovares patogênicos e não reagiram com sorovares saprófitas. Os MAbs possuem potencial para uso em testes de diagnóstico de leptospirose.

LTB-R1: an alternative to swine mycoplasmal pneumoniae control

Mycoplasmal pneumoniae is the main respiratory disease in swine. The most efficient way to control it is through the use of vaccines (bacterins), whose production cost is high. The objective of this work was to develop a new alternative for controlling Swine Mycoplasmal Pneumoniae, based on a recombinant subunit vaccine containing the R1 region of P97 adhesin of Mycoplasma hyopneumoniae fused to the B subunit of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli (rLTB-R1). In this work we report the amplification of the genes, genetic fusion between LTB and R1 coding sequences, cloning, construction of the expression vector, as well as expression and purification of rLTB-R1 in E. coli.

A Pneumonia Micoplásmica é a doença respiratória mais importante dos suínos. A forma mais eficaz de controlá-la é mediante a utilização de vacinas (bacterinas), cujo custo de produção é elevado. Uma nova alternativa para o controle desta doença, baseada em uma vacina de subunidade recombinante contendo a região R1 da adesina P97 de Mycoplasma hyopneumoniae fusionada a subunidade B da enterotoxina termolábel de Escherichia coli (rLTB-R1), foi o alvo deste trabalho. Nele abordou-se a amplificação dos genes, a fusão genética entre as seqüências codificadoras para LTB e R1, a clonagem, a construção do vetor de expressão, assim como a expressão em E. coli e purificação da rLTBR1.

Effect of the Kozak sequence on seroconversion of mice immunized with a DNA vaccine against swine colibacilosis

The neonatal diarrhea in swine caused by enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is responsible for high mortality and low growth rate in pigs and it is mainly dependent on the capacity of E. coli to attach to the surface of the small intestine, a property mediated by fimbria. In this study the faeC gene, which codes for the minor fimbrial subunit of E. coli K88ab, was cloned in the eukaryotic expression vector pcDNA3, associated or not to the Kozak sequence. Plasmid DNA of the two versions of the vaccine candidate was inoculated in mice by the intramuscular route, in two doses, at 0 and 21 days. The animals that received the DNA vaccine containing faeC associated to the Kozak sequence presented seroconversion significantly higher (P 0.05) than the one vaccinated with pcDNA3/faeC without the Kozak sequence.

A diarréia neonatal em suínos causada por Escherichia coli produtora de enterotoxinas (ETEC) é responsável por alta mortalidade e baixa taxa de crescimento de leitões. A habilidade de tais cepas causar doença é dependente principalmente da capacidade de E. coli aderir-se a mucosa do intestino delgado, que é mediada por fímbrias. Neste estudo o gene faeC, que codifica a subunidade menor da fímbria de E. coli K88ab, foi clonado no vetor de expressão em eucariotos pcDNA3, associado ou não à seqüência de KozaK. DNA plasmidial das duas versões da vacina foi inoculado em camundongos via intra-muscular, em duas doses, nos dias 0 e 21. Os animais que receberam a vacina de DNA contendo o faeC associado a seqüência de Kozak apresentaram soroconversões significativamente maiores (p 0,05) que os vacinados com pcDNA3/faeC sem a seqüência de Kozak.

Leptospirosis diagnosis using Nested-PCR

Leptospirosis is a worldwide sanitary problem. Its clinical signs resemble that of other diseases like Dengue and Flu, and it is difficult to distinguish between them. Currently available diagnostic methods shown low sensitivity and specificity. Efforts have been made to develop simpler, faster and more efficient diagnostic methods. The aim of this work was to evaluate and optimize a Nested-PCR method for diagnosis of leptospirosis. Primers were designed to amplify a 264 bp region within the LipL32 gene. The sensitivity and specificity of the assay was evaluated using seven saprophytic serovars and 35 pathogenic serovars. This technique showed to be very specific for pathogenic serovars, however it lacked sensitivity. In order to enhance the sensitivity, another primer pair was designed which amplify a 183 bp region within the 264 bp region in lipL32 gene, and used in a Nested-PCR assay. This approach was much more sensitive than traditional PCR.

A leptospirose constitui um problema sanitário de importância mundial. Esta doença caracteriza-se por apresentar sintomas muito parecidos com os de outras doenças como a dengue e a gripe e, clinicamente é difícil de distingui-las. Técnicas de diagnóstico da leptospirose atualmente disponíveis apresentam baixa sensibilidade e ou especificidade. Por isso, tem havido um grande esforço no sentido de desenvolver testes rápidos e eficientes, baseados em técnicas de biologia molecular. Este trabalho objetivou a avaliação e otimização do Nested-PCR, para o diagnóstico de leptospirose. Para isso foi desenhado um par de primers que amplifica uma região de 264 pb do gene LipL32. A sensibilidade e especificidade do teste foram avaliadas utilizando 7 sorovares saprófitas e 35 sorovares patogênicos. Este PCR mostrou-se específico para leptospiras patogênicas, porém a sensibilidade não foi muito alta. Com o objetivo de melhorar a sensibilidade do teste , foi desenhado outro par de primers que amplifica uma região de 183 pb do gene LipL32, interna a de 264 pb para a realização do Nested-PCR. Nesta reação foi utilizado como DNA molde o produto da primeira amplificação. O Nested-PCR mostrou-se mais sensível que o PCR normal, pois foi capaz de detectar um baixo número de células bacterianas.